ReadyAMP^®PCR直接擴增技術(shù)應(yīng)用在細菌16s rDNA鑒定中的流程

隨著分子學(xué)的發(fā)展，細菌16S rDNA序列的鑒定逐漸成為細菌特征的“金標準"。大部分實驗室中正逐步使用該方法替代傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)、生化鑒定等方法。16S rDNA因其序列在物種間的高度多樣性，成為細菌分類研究的“分子鐘"，素有“細菌化石"之稱。

16S rDNA鑒定意義重大，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：

1、測序結(jié)果和已知細菌16S rDNA序列數(shù)據(jù)庫進行比較，可以確定未知細菌的分類和物種關(guān)系。對臨床微生物和環(huán)境微生物意義重大。

2、通過比較不同細菌的16S rDNA序列，可以推測相互之間的親緣關(guān)系和進化關(guān)系，進而了解細菌的進化和演化史。

3、通過環(huán)境樣本中細菌16S rDNA序列比較，可以分析和總結(jié)出不同細菌在不同環(huán)境下對自然界的功能和作用。

4、菌落中16S rDNA可變區(qū)進行鑒定，可提供菌落組成、表達豐度、以及系統(tǒng)進化分析。為菌落與環(huán)境、環(huán)境與人類的相互作用提供數(shù)據(jù)支持。

但是常規(guī)獲得16S rDNA序列的方法如圖1。實驗室工作人員zui常用的細菌DNA提取試劑盒，也就是通用的離心柱式提取基因組

圖1 傳統(tǒng)離心柱提取和ReadyAMP®快速16S rDNA細菌鑒定試劑盒對比

DNA。作為傳統(tǒng)且經(jīng)典方法，該方法對長期從事提取工作的實驗室人員來說存在幾個難點：

1、提取時間長達40-90分鐘

2、需要使用溶菌酶、蛋白酶K等酶類

3、需要使用多種設(shè)備，包括恒溫浴、離心機等

4、革蘭氏陽性菌產(chǎn)量低

針對以上痛點和難點，我司開發(fā)了ReadyAMP^®快速16S rDNA細菌鑒定試劑盒，操作流程見圖1。該方法最大的特點如下：

1、簡單便捷、一步完成；

2、檢測線低至10⁴個/mL細菌；

3、檢測樣本豐富，例如對數(shù)生長期菌液、菌斑、甘油菌等；

4、樣本需求量低，例如菌液/甘油菌1-3μL、菌斑1個；

5、革蘭氏陰性菌100%檢出；

6、革蘭氏陽性菌99.99%檢出；

7、難培養(yǎng)樣本有效；

8、珍貴樣本有效；

已驗證的細菌包括：

案例A——對數(shù)生長期細菌快速擴增16S rDNA

以對數(shù)生長期菌液為模板，使用ReadyAMP^®快速16S rDNA細菌鑒定試劑盒（貨號Nu-16S01）擴增16S rDNA，以菌液對應(yīng)硅膠柱提取基因組為對照。

案例B——單菌落快速擴增16S rDNA

以對單菌置生理鹽水中為模板，使用ReadyAMP^®快速16S rDNA細菌鑒定試劑盒（貨號Nu-16S01）擴增16S rDNA，以菌液對應(yīng)硅膠柱提取基因組為對照。